Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Прибор. Прибор для ИЭФ состоит из:
- управляемого генератора для создания постоянного потенциала, тока и мощности; используются потенциалы величиной 2500 В, они считаются оптимальными для используемых условий работы; рекомендуется источник тока, имеющий постоянную мощность до 30 Вт;
- жесткая пластиковая ИЭФ камера, в которой находится охлаждаемая пластинка или подходящий материал, служащий основой для нанесения геля;
- пластиковая крышка с платиновыми электродами, которые соединены с гелем с помощью бумажных фитилей подходящей ширины, длины и толщины, пропитанных растворами анодных и катодных электролитов.
ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ В ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ГЕЛЯХ: ПОДРОБНАЯ МЕТОДИКА
Следующая методика представляет собой подробное описание процедуры ИЭФ в пластинах полиакриламидного геля, используемой, если иное не указано в монографии.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГЕЛЕЙ
Матрица формования. Матрица формования (см. Рисунок 2.2.54.-1) состоит из стеклянной пластинки (A,) на которую для облегчения работы с гелем помещена полиэфирная плёнка (B), одной или нескольких распорных деталей (C), второй стеклянной пластинки (D) и зажимов, скрепляющих всю конструкцию.
Рисунок 2.2.54.-1 - Матрица формования
7,5%-ный полиакриламидный гель. Растворяют 29,1 г акриламида R и 0,9 г метиленбисакриламида R в 100 мл воды R. К 2,5 объёмам этого раствора прибавляют смесь амфолитов, указанных в частной статье, и разбавляют до 10 мл водой R. Раствор аккуратно перемешивают и дегазируют.
Приготовление формы. Полиэфирную плёнку помещают на нижнюю стеклянную пластинку, вставляют распорную деталь, помещают вторую стеклянную пластинку и скрепляют конструкцию зажимами. Перед использованием раствор помещают на магнитную мешалку и прибавляют к нему 0,25 объёма 100 г/л раствора аммония персульфата R и 0,25 объёма тетраметилэтилендиамина R. Немедленно заполняют раствором пространство между стеклянными пластинками формы.
Методика. Форму разбирают на составные части и, используя полиэфирную плёнку, переносят гель на охлаждённую подложку, увлажнённую несколькими миллилитрами подходящей жидкости, избегая образования воздушных пузырьков. Готовят исследуемый раствор и растворы сравнения как указано в частной статье. Для нанесения образца помещают полоски бумаги размером приблизительно 10 мм х 5 мм на поверхность геля и пропитывают каждую предписанным количеством исследуемого раствора и раствора сравнения. Также наносят предписанное количество раствора белков с известными величинами изоэлектрических точек, служащих в качестве маркеров рН для градуировки геля. В некоторых протоколах вместо использования импрегнированных бумажных полосок используется гель, который имеет желобки, предназначенные для помещения раствора образца. Отрезают 2 полоски бумаги длиной, соответствующей длине геля, и пропитывают их растворами электролитов: кислотой для анода и щелочью для катода. Составы анодного и катодного растворов приводятся в монографиях. Эти бумажные фитильки помещают на каждую сторону геля на расстоянии нескольких миллиметров от его границы. Устанавливают крышку так, чтобы электроды пришли в контакт с полосками бумаги (соответственно анодным и катодным полями). Выполняют изоэлектрическое фокусирование при использовании электрических параметров, описанных в монографии. Когда миграция смеси стандартных белков стабилизируется, электрический ток выключают. С помощью пинцета удаляют полоски, предназначенные для нанесения образца, и 2 электродных фитилька. Погружают гель в фиксирующий раствор для изоэлектрического фокусирования в полиакриламидном геле R. Выдерживают при аккуратном встряхивании при
комнатной температуре в течение 30 минут. Удаляют раствор высушиванием и добавляют 200 мл обесцвечивающего раствора R. Выдерживают при перемешивании в течение 1 часа. Высушивают гель, добавляют кумасси окрашивающий раствор R. Выдерживают в течение 30 минут. Обесцвечивают гель путём пассивной диффузии обесцвечивающего раствора R до тех пор, пока на чистом фоне не станут хорошо видны полосы. Отмечают положение и интенсивность полос на электрофореграмме, как указано в монографии.
ИЗМЕНЕНИЯ ПОДРОБНОЙ МЕТОДИКИ (ПРЕДМЕТ ВАЛИДАЦИИ)
Там, где делается ссылка на общую методику изоэлектрического фокусирования, изменения в методологии или методике изоэлектрического фокусирования могут быть предметом валидации. Они включают в себя:
- использование имеющихся в продаже гелей заводского производства, а также окрашивающих и обесцвечивающих наборов,
- использование фиксированных градиентов рН,
- использование стержневых гелей,
- использование кассет геля различных размеров, включая ультратонкие (0,2 мм) гели,
- изменения в методике нанесения образца, включающие различные объёмы образца или использование шаблонов или фитильков, изготовленных не из бумаги,
- использование альтернативных условий перемещения, включающих изменения электрического поля в зависимости от размеров геля и оборудования, а также использование фиксированных времен миграции вместо субъективной интерпретации стабильности полосы,
